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文久3年（1863）2月に清川八郎が江戸で「京都防衛のため」壬生浪士隊を募集すると、近藤と共にこれに参加しました。しかし清川は一行を京都まで連れて行くと、浪士隊の目的は尊皇攘夷であると言い出したため、空中分解。清川は江戸に戻り、のち暗殺されます。

文久3年（1863）2月，清川八郎在江户招募“为防卫京都”的壬生浪士队，岁三于是和近藤一同参加了浪士队。但是清川将这一行人带至京都后，因明言浪士队的目的是为尊皇攘夷队伍中途解散。清川回到江户后不久就被暗杀。

一方、京都に取り残された近藤や土方たちは京都守護職の会津藩主松平容保に願い出て、同年8月「新撰組」を結成。初代局長には芹沢鴨が就任しました。

另一方面，仍滞留京都的近藤、土方等人向京都守护会津藩主松平容保请愿，同年8月组成了“新撰组”。芹泽鸭就任第一代局长。

しかし芹沢は傍若無人の振る舞いがあり、9月18日土方らにより粛正。代わって近藤が2代目局長になりました。この京都での近藤局長時代の新撰組が最も輝いており副長となった土方と共に、尊王攘夷派や倒幕派の武士たちを次々に殺害していきました。

可是，芹泽鸭屡行目中无人之事，9月18日被土方清除。近藤取而代之担任新撰组第二代局长。（近藤）和成为在京都的近藤局长时代的新撰组最耀眼的副长土方一起，陆陆续续地对尊王攘夷派和倒幕派武士大开杀戒。

文久3年8月13日 火烧大和屋文久 3年 8月13日　大和屋焼き討ち

文久3年8月13日 火烧大和屋

元治元年 6月 5日　池田屋で長州藩士ら16名を殺害（池田屋騒動）

元治元年6月5日 在池天屋斩杀16名长洲藩士（池田屋骚动）

慶応 2年 9月12日　三条大橋で土佐藩士を襲撃し2名を殺害

庆应2年9月12日，在三条大桥袭击土佐藩士并斩杀2名

慶応 3年12月 7日　天満屋で海援隊と乱闘

庆应3年12月7日 在天满屋于海援队激斗

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